توالی یابی به روش سنگر

توالی یابی ژنوم انسان و سایر ارگانیسم ها در دهه های اخیر در مرکز توجه زیست پزشکی قرار گرفته است و زیر بنای پزشکی شخصی را به وجود آورده است. در این میان روش های توالی یابی نیز پیشرفت های فراوانی داشته اند بطوری که روش های  گران و زمانبر جای خود را به روش های ارزان و سریع تر داده اند. با این و جود در بسیاری از موارد هنوز روش توالی یابی سنگر به عنوان روش استاندارد طلایی مورد استفاده قرار می گیرد. از این رو مختصرا شرحی از این روش را بازگو می‌کنیم.

 عنصر کلیدی در روش توالی یابی سنگر استفاده از دی دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات ddNTP به عنوان خاتمه گر فرآیند سنتز رشته ی جدید در PCR است که تحت عنوان توالی یابی به روش ختم سنتز زنجیره نیز شناخته می شود. در این روش مانند PCR از رشته ی الگو، آنزیم پلیمراز و  دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات dNTP استفاده می شود و علاوه بر موارد  فوق دی دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات ddNTP هم به مواد واکنش اضافه می گردد. اما نکته اینجاست که به ازای هر ddNTP یک واکنش مستقل انجام می شود. بدین شکل که اجزای واکنش در چهار تیوب تقسیم می‌شوند و به هر کدام تنها یکی از ddNTPها (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) اضافه می شود. محصول این واکنش قطعات DNA با طول های متفاوت است. هر کدام از محصولات روی ژل پلی اکریل آمید ران شده و بر اساس سایز خوانش بصورت دستی آنالیز می شود.

استفاده از برچسب های فلوروسنت که به هرکدام از ddNTP ها متصل می شوند و بهره گیری از دستگاه های الکتورفورز موئینه باعث شده فرآیند توالی یابی به روش ختم زنجیره PCR با سرعت و دقت بالاتری انجام شود و قطعاتی با طول 1KB در مدت بسیار کوتاهی توالی یابی شوند.

در این روش به هرکدام از ddNTP ها یک برچسب فلوروسنت متصل می شود. این ddNTP ها پس از اتصال به رشته در حال ساخت باعث توقف سنتز شده، بنابراین در هر دور از واکنش PCR قطعاتی با طول های مختلف ایجاد می شود. الکتروفورز این محصولات به روش موئینه ای و استفاده از خوانشگرهای فلوروسنت که توانایی تشخیص هر کدام از ddNTP ها را دارند باعث می شود توالی رشته ی مربوطه خوانش شود.

ساخت الکتروفورزهای اختصاصی برای توالی یابی باعث افزایش سرعت و کاهش زمان این فرآیند شده است. این دستگاه که با عنوان Genetic analyzer شناخته می شوند عنصری ضروری برای آزمایشگاه های ژنتیک هستند. 

 

توالی یابی (سکانس) به روش سنگر

 

نظرات

نظر خود را اضافه کنید